根據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》《體外診斷試劑注冊管理辦法》，“組織體外診斷試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的制備和標(biāo)定工作”的責(zé)任主體為中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）。

目前，中檢院可以提供113種注冊檢驗用體外診斷試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品和參考品，其中有8種人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考品。另外，中檢院還正在開展如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測參考品、單倍型基因組DNA參考品、流產(chǎn)組織拷貝數(shù)變異檢測參考品、HLA分型參考品及脆性X綜合征FMR1基因突變參考品等人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考品的研制工作。

為進(jìn)一步規(guī)范這類體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作，筆者對人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)研制過程中的一般技術(shù)要求進(jìn)行了梳理，供業(yè)內(nèi)同仁交流探討。

參考物質(zhì)原料選擇及確證

人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)通常由檢測基因位點(diǎn)陽性參考品（有時也稱為突變陽性參考品）、檢測基因位點(diǎn)陰性參考品（有時也稱為野生型以及其他同源基因位點(diǎn)陽性參考品）、檢測限參考品及精密性參考品等組成，用于全面控制診斷試劑的質(zhì)量。

陽性參考品用來控制試劑的陽性符合率，由一定數(shù)量的陽性樣品組成。通常是從大量樣品中根據(jù)不同目的篩選出來，要求盡可能覆蓋靶基因多種等位基因或突變類型，應(yīng)具有代表性、滿足臨床樣本的分布類型、地域或民族等群體遺傳

標(biāo)記代表性，并經(jīng)過確證。同時，還可以根據(jù)需求采用相應(yīng)基因突變的永生化淋巴細(xì)胞系、基因編輯突變細(xì)胞系等。

陰性參考品用來控制試劑的陰性符合率，由一定數(shù)量的陰性樣品組成。通常來自檢測靶基因野生型或其他突變類型人群樣本、同源基因位點(diǎn)陽性人群樣品和（或）易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的樣品。為了控制試劑的非特異反應(yīng)，并和陽性參考品一致，根據(jù)試劑檢測樣本類型，應(yīng)考慮陰性參考品的基質(zhì)，并逐一確證。同時，陰性參考品也可以根據(jù)需求采用特定基因野生型或相關(guān)基因突變類型明確的永生化淋巴細(xì)胞系、基因編輯突變細(xì)胞系等。

檢測限參考品通常由一份或多份經(jīng)過確證的稀釋陽性樣品組成，用來控制試劑的檢測限，即試劑所能檢出的樣品中陽性物質(zhì)的最低限度。檢測限參考品設(shè)置應(yīng)根據(jù)試劑的臨床預(yù)期用途進(jìn)行合理設(shè)立，如臨床預(yù)期用途為靶向藥物指導(dǎo)的檢測試劑，其檢測限參考品設(shè)置建議和臨床治療以及臨床樣本中的實(shí)際分布相關(guān)聯(lián)，并采用具有藥效相關(guān)的濃度和比例進(jìn)行設(shè)置。同時，建議設(shè)置多個梯度，主要從核酸濃度和突變所占百分比兩個方面進(jìn)行評價。

精密性參考品通常由一份或幾份經(jīng)過確證的陽性樣品組成，用來控制試劑的重復(fù)性，建議包括弱陽性、中陽性或強(qiáng)陽性水平的精密度驗證；必要時設(shè)置陰性參考品重復(fù)性驗證。

參考物質(zhì)的制備和標(biāo)定

在制備人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)時，應(yīng)根據(jù)其品種要求進(jìn)行配制、稀釋、分裝、凍存，必要時進(jìn)行凍干熔封。

通常，人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)一般采用液體冰凍的方式保存，不需要進(jìn)行凍干操作。在稀釋過程中，應(yīng)對稀釋液進(jìn)行充分驗證。稀釋液一般采用的是TE溶液、去核酸酶水以及野生型基因組DNA溶液、處理后的臨床樣本等。稀釋液的選擇應(yīng)保證不干擾后續(xù)檢測、有助于更好地模擬臨床樣本，并不對參考品的濃度定量和/或比例確定造成干擾。

而凍干一般需加保護(hù)劑等物質(zhì)，該類物質(zhì)應(yīng)對參考物質(zhì)的特性量值、穩(wěn)定性和試驗操作過程無影響，并且其本身在干燥時不揮發(fā)。需要干燥保存的，應(yīng)在分裝后立即進(jìn)行凍干和熔封。凍干的水分含量應(yīng)不高于3.0％。整個分裝、凍干和熔封過程，應(yīng)保證對各安瓿間主要指標(biāo)和穩(wěn)定性的一致性不產(chǎn)生影響。

在對人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)定時，應(yīng)首先確定是否有國際標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，如果有，以其作為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定待制備的參考物質(zhì)；如果沒有，則依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、指南、規(guī)范或其他經(jīng)過驗證的方法來制定該參考物質(zhì)的定值方案和方法。為保證新研制參考品的適用性，在選擇參與協(xié)作標(biāo)定的試劑盒時，應(yīng)注意其技術(shù)原理、試劑盒生產(chǎn)企業(yè)的代表性及覆蓋面，以確定其在實(shí)際工作中的適用情況。

人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)主要控制的指標(biāo)有陰陽性符合率、檢測限及重復(fù)性等，不同類型的人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)，對這些指標(biāo)的考核標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同，應(yīng)依據(jù)各種人類基因檢測相關(guān)試劑的特點(diǎn)建

立其相應(yīng)的考核標(biāo)準(zhǔn)。

參考物質(zhì)的穩(wěn)定性研究

人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)穩(wěn)定性研究可采用適宜方式進(jìn)行，如經(jīng)驗資料或進(jìn)行加速破壞試驗。進(jìn)行加速破壞試驗時，一般根據(jù)制品性質(zhì)放置不同溫度、不同時間來測定考核指標(biāo)，以評估其穩(wěn)定性。

參考物質(zhì)建立后，還應(yīng)定期進(jìn)行期間核查，觀察其穩(wěn)定性；同時，還應(yīng)對其反復(fù)凍融穩(wěn)定性進(jìn)行考察。根據(jù)國際慣例，目前人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)不設(shè)“有效期”，由中檢院對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定期監(jiān)測。

負(fù)責(zé)人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)研制工作的實(shí)驗室在工作完成后，還要經(jīng)過嚴(yán)格的審評審批，獲得簽批的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)進(jìn)行貼標(biāo)簽及外包裝工作，標(biāo)簽內(nèi)容一般包括中文名稱、批號及標(biāo)識量，超出規(guī)定用途時，使用者應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用性負(fù)責(zé)。

該類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的貯存條件應(yīng)有利于基因特性的穩(wěn)定，通常為低溫冷凍保存，對貯存情況應(yīng)定期檢查并記錄。對于某些有特殊貯存要求的，應(yīng)有特殊的貯存措施，并應(yīng)在標(biāo)簽與使用說明書中注明。

人類基因檢測相關(guān)試劑評價國家參考物質(zhì)應(yīng)有專人負(fù)責(zé)保管和發(fā)放，由中檢院直接提供給各生產(chǎn)單位標(biāo)定其工作參考品或用于產(chǎn)品檢定。

（摘編自《中國藥事》2018年8月第32卷第8期，作者：曹麗梅 王一平 袁偉媛 黃杰）